إستخلاص وتنقية الفلافونيات من أوراق نبات الزيزفون وتقييم الفعالية ضد المايكروبات

الباحث العلمي/ د. انعام نوري علي

مركز معالجة البيئة والمياه – قسم البحوث البيئية – هيئة البحث العلمي

 وزارة التعليم العالي – العراق

الباحث / سؤدد عبد الاله محمد

مساعد باحث /  إيمان محمد كاظم

مساعد باحث /   لؤي نزار باقر

مساعد باحث /   رشا خليل فرحان

مركز التطبيقات الصناعية وبحوث المواد – قسم العدد الطبية – هيئة البحث العلمي

 وزارة التعليم العالي – العراق

Swddalbasy@gmail.com

009647702964968

الملخص  :

يعتبر نبات الزيزفون من النباتات المهمة طبياً ويستخدم منذ القدم لعلاج حالات التهاب الجروح والحروق والاكزيما.  تناول البحث الكشف عن المادة الفعالة الفلافونيدات ( الكوارسيتن ) باستخدام الكحول الاثيلي وقاعدة هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة 50% وظهر اللون لبني الغامق دلالة على  الكشف الموجب . ثم استخلصت الفلافونات باستخدام الكحول الاثيلي بتركيز %70 ولمدة ثلاث أيام بعد التجفيف بدرجة حرارة  40 ºم  ، تم حساب الوزن الجاف مقدراً بالغرام أو الملليغرام. ومن التركيز الاصلي تم تحضير سلسلة من التراكيز  (200, 100, 50, 25) ملغرام / مللتر وشخصت المادة الفعالة (الكوارستين) بواسطة جهاز HPLC عند زمن احتجاز 7.5 دقيقة.

جربت التراكيز المختلفة من المستخلص النباتي على العزلات الجرثومية لغرض فحص حساسية هذه العزلات وتشمل البكتريا العنقودية الذهبية Staphyllococcus aureus و  oxytoca Klebsiella  و الخميرة الكانديدا Candida albicans المسببة لالتهاب الجلد واستخدمت طريقة الحفر (wells ) .

النتائج تشير الى ان اعلى منطقة تثبيط للبكتريا العنقودية  (21  ملمتر) و لبكتريا Klebsiella 32 ملمتر) والخميرة الكانديدا (31 ملمتر)  وان التركيز المثبط الادنى MIC لجميع العزلات ( 100 ملغرام / مللتر) .

الكلمات المفتاحية : نبات الزيزفون ، الفلافونيدات ، البكتريا والخميرة,الالتهابات الجلدية

 

Extraction and Purification of Flavonoids from Linden Leaves and Evaluation of Activity against Michobos

Suadad Abdul-Elah Mohammad

1Center for Industrial Applications and Materials Research – Medical Equipment Department – Scientific Research Authority – Ministry of Higher Education

 Inaam Noori Ali

 Iman Mohammad Kazim

 Luay Nizar Baqir

Rasha Khalil Farhan

Centre for Environmental and Water Treatment – Environmental Research Department – Scientific Research Authority – Ministry of Higher Education

Abstract:

Linden is considered one of the important medicinal plants and has been used since ancient times to treat cases of wound inflammation, burns and eczema. The research dealt with the detection of the active substance flavonoids (quercetin) using ethyl alcohol and potassium hydroxide base at a rate of 50%, and the color appeared dark brown indicating a positive detection. Then, flavonoids were used using ethyl alcohol at a concentration of 70% for three days after drying at a temperature of 40 ° C the dry weight was calculated in grams or milligrams. From the original concentration, a series of concentrations (200, 100, 50, 25) mg/ml were prepared, and the active substance (quercetin) was identified by HPLC device at a retention time of 7.5 minutes. Different concentrations of the plant extract were tested on bacterial isolates for the sensitivity test of these isolates, including Staphylococcus aureus and Klebsiella oxytoca and the yeast Candida albicans. Wells’ method was used. The results indicate that the highest inhibition zone for staphylococcus bacteria (21 mm), for Klebsiella bacteria (32 mm), and Candida yeast (31 mm), and that the minimum inhibitory concentration (MIC) for all isolates (100 mg/ml)

Keywords: Linden plant, flavonoids, bacteria and yeast, Dermatitis.

المقدمة :

نبات الزيزفون ينتمي الى عائلة (Tiliacea) واسمه الانكليزي Linden  أو Lime وله انواع مثل  Tillia cordata و  Tilia platyphyllos و Tilia americana . ينمو في أوربا والمناطق الشمالية من قارة آسيا وشمال امريكا وله اوراق قلبية مسننة اذا كانت صغيرة يسمى Tilia cordata و الكبيرة تسمىTilia platyphyllos   وازهارها تكون بيضاء مائلة للأصفرار

“(Natural Health product 2017)و  (Barens etal. 2007)

المكونات الكيميائية لهذا النبات يحتوي على الفلافونيدات مثل quercetin  ,Kampferol  و Myricetin والاحماض الفينولية مثل caffeic و chlorogenic و Coumaric acid. والزيوت الطيارة مثل eugenol و nephol و Varnesol وأحماض امينية  (Evan et al, 2009).

الاستخدامات الطبية لهذا النبات لعلاج الالتهابات التنفسية والسعال واللتهاب البلعوم والفم والحنجرة وخاصة الاوراق (Qanaleh et al.,2020) ويعتبر النبات مضاد للبكترية. ومضاد للالتهاب وخاصة الالتهابات الجلدية ومضاد للأكسدة. ومن اهم المواد التي تختزل الجذور الحرة هي التانينات والفلافونيدات وايضاً هذه المواد تحمي الجلد من البكتري وتساعد على التئام  الجروح، كما ان زهور هذا النبات تحتوي على الزيوت الطيارة التي تساعد على ترطيب وتنعيم الجلد ومضاد للبكتريا في نفس الوقت ويستخدم ايضا في علاج حب الشباب acne ويستخدم في صناعة الصابون والمنظفات ومرطبات الجلد وحماية الشعر وازالة التجاعيد .(,2019 ,.Ismail et al) و (Tillia cordata flower,2024) ان المركبات الفعالة الموجودة في الزهور والاوراق لها فعاليةمضادة للسرطان (Zhou etal.,2024).

• أهمية البحث: ايجاد عقار نباتي من نبات الزيزفون لعلاج الالتهابات الجلدية المسببة من البكتريا والفطريات
• مشكلة البحث : محاولة إيجاد الفعالية التثبيطية من مستخلص اوراق نبات الزيزفون ضد البكتريا والفطريات المسببة للالتهابات الجلدية .
• منهجية البحث: عملية الكشف عن المادة الفعالة الفلافونيدات واستخلاصها وتشخيصها بواسطة جهاز HPLC و بالذات مركب (quercetin) . ثم عمل تراكيز مختلفة من المستخلص النباتي 200,100,50,25 ملغرام / مللتز.

لدراسة تأثير هذا المستخلص بطريقة الحفر ضد البكتريا العنقودية الذهبية والكليبسيللا والخميرة الكانديدا ومعرفة العزلات المقاومة من الحساسة . وأيهما اكثر مقاومة من الحساسية وايهما اكثر مقاومة للمستخلص واكثر حساسية له.

عن طريق فياس قطر منطقة التثبيط وتحديد التركيز المثبط الادنى (MIC) ثم تحليل البيانات فروق معنوية ام حول تأثر )المستخلص على العزلات الجرثومية بطريقة التحليل الاحصائي (ANOVA) .

• حدود البحث : تم اجراء البحث في قسم العدد الطبية – هيئة البحث العلمي – وزاة التعليم العالي .
• تاريخ العمل : كانون الثاني 2024 – ايلول 2024

* فروض البحث :  نفترض إن المواد الفعالة في البيانات تمتلك فعالية تثبيطية ضد البكتريا والفطريات وحتى الفايروسات لذلك في هذا البحث تم التركيز على المادة الفعالة (الفلافونيدات) باعتبارهما الصبغة النباتية المهمة والفعالة في تثبيط الجراثيم المسببة للالتهابات الجلدية وتعتبر نبات الزيزفون وخاصة أوراقه مهمة منه الناحية الطبية اي يعمل كمضاد للجراثيم ومضاد للأكسدة في نفس الوقت .

* الدراسات السابقة :

اثبتت احدى الدراسات إن المركبات الفعالة لنبات الزيزفون مثل Rutin, quercitin.

انها مواد مثبطة للجذور الحرة وكذلك للبكتريا الموجبة لصبغة گرام مثل البكتريا العنقودية الذهبية Bacillus Subtilis  و  Staphylococcus aureus والبكتريا السالبة لصبغة كرام مثل Pyogenes Streptococcus  المسببة لالتهاب اللوزتين والبلعوم ( 2020(parlovic et al.,

كما ان عسل نبات الزيرتون وجد انه يمتلك فعالية مضادة للبكتريا العنقودية الذهبية وبكتريا القولون coli  E. (Gruznov etal., 2024)

• الهدف من البحث : الكشف واستخلاص المادة الفعالة في اوراق نبات الزيزفون وهي الفلافونيدات (الكوارسيتن  quercetin ودراسة تأثيرها ضد البكتريا العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus و بكتريهoxytoc  والخميرة الكانديدا Candida albicans المسببة للالتهابات الجلدية

 

• الهدف من الدراسة :

هو الكشف واستخلاص وتشخيص المادة الفعالة في اوراق نبات الزيزفون وهي الفلافونيدات (كوارستين quercetin ) ودراسة تاثيرها ضد البكتريا العنقودية الذهبية وبكتريا الكلبسيلا والخميرة الكانديدا المسببة للالتهابات الجلدية بطريقة الحفر وتحديد التركيز المثبط الادنى ( MIC ) لكل عزلة.

• المواد وطرائق العمل:

1- النبات :- حُصل عليه من السوق المحلية بشكل أوراق جافة شُخص النبات بالاعتماد على موسوعة  Encyclopedia of life, 2013 ,    وحفظت في اكياس نايلون لحين الاستعمال.

2- المواد الكيميائية :- حُصل على المواد الكيميائية من مختبرات مركز العدد الطبية مثل  هيدروكسيد البوتاسيوم KoH (شركة Analah ) بنقاوة  %99 والكحول الأثيلي Ethanol  (شركة Hayman ) بنقاوة % 99 .

3- الاجهزة المختبرية : إستخُدم جهاز المبخر الدوار Rotary evaportor (شركة Heidolf   ) للتخلص من السوائل والفرن oven (شركة (GSC للحصول على مستخلص جاف. وتم التجفيف بدرجة حرارة 40 ºم وجهاز الكروموتوگرافيا السائلة

الضغط الفائق HPLC (شركة Shimazo) لغرض تشخيص المادة الفعالة الفلافونيدات  (quercetin ).

٤- الاوساط الزرعية : مثلNutrient agar  و Nutrient broth المنتجة من شركة  LAB استخدمت لغرض تنمية وحفظ العزلات البكتيرية وايضاً لفحص حساسية البكتريا للمستخلص النباتي .

5- العزلات الجرثومية : حُصل عليها من مختبر الصحة المركزي / وزارة الصحة وتشمل البكتريا العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus الموجبة لكرام والبكتريا Klebsiella oxytoca السالبة لصبغة كرام والخميرة الكانديدا Candida albicans المسببة للالتهابات الجلدية.

٦- الكشف عن الفلافونات : تم الكشف بأستخدام KOH بتركيز %50 وكحول اثيلي %50  يضاف الكاشف الى المستخلص المائي لاوراق نبات الزيزفون بكميات متساوية وظهور اللون البني الاصفر دلالة على الكشف الموجب  (Al-Hani, 2008)

7- إستخلاص الفلافونيدات : تم الاستخلاص بواسطة الكحول الاثيلي بتركيز 70% يضاف الى الاوراق المجففة المسحوقة ويترك لمدة ثلاث أيام  ثم يرشح بواسطة اوراق ترشيح ويركز بجهاز المبخر الدوار ثم يضاف الماء الحار بدرجة حرارة  100ºم للتخلص من الشوائب ويرشح مرة أخرى ويجفف بالفرن 40ºم  للحصول على المستخلص الجاف ويحسب الوزن بالغرامات أو الملليغرام g,mg (Al-Hani, 2008) 8- الكشف الكمي : يتم الكشف الكمي عن المادة الفعالة (guercetin ) و تشخيصها بواسطة جهاز (HPLC) وتمت المقارنة مع المحلول القياسي للمادة الفعالة بزمن إحتجاز (7.5) وطول موجي (Nm254) وإستخدم العمود  sc 18 (250 X 4.6 Idmm) . وتركيز المادة الفعالة يحسب بموجب المعادلة التالية:

تركيز المادة (العينة) = تركيز المحلول القياسي × مساحة العينة ÷ مساحة المحلول القياسي

9- الفحوصات البايولوجية : أستخدمت طريقة الانتشار بالأكار ( طريقة الحفر) باستخدام ثاقبة فلينية Cork borer بقطر 6 ملمتر mm ووضع المستخلص في كل حفره بحجم 0.3 مللتر   واستخدمت التراكيز ملغرام / مللتر .

(50,25  ، 100 ،200) وحفرة السيطرة تحتوي ماء مقطر معقم ووضعت الاطباق في الحاضنة بدرجة حرارة 37  ºم لمدة 24  ساعة ثم تقاس منطقة الثبيط حول كل حفرة بالملمتر باستخدام المسطرة  تم قياس قطر منطقة الثبيط بالمسطرة بالملمتر .(Qanaleh etal., 2020)

10- التحليل الاحصائي: تم التحليل الاحصائي باستخدام اختبار (ANOVA) حول تأثير المستخلص النباتي على العزلات الجرثومية وبمستوى احتمالية 0.05 لمعرفة كون المستخلص النباتي له تأثير معنوي ام غير معنوي .

النتائج والمناقشة :

يبين الشكل (1) ظهور اللون البني في المستخلص المائي لنبات الزيزفون عند إضافة الكاشف وهو دلالة على الكشف الموجب للفلافونات .

الشكل (1) ظهور اللون البني في المستخلص المائي لنبات الزيزفون عند اضافة الكاشف دلالة على الكشف الموجب للفلافونيدات

اما الشكل  (2) يوضح ظهور المادة الفعالة  (quercetin)عند زمن احتجاز ( 7.5) مقارنة مع المحلول

القياسي استخدام جهاز (HPLC) بطول موجي Nm254 وكان تركيز المادة الفعالة (ppm1)

الشكل (2) ظهور المادة الفعالة الفلافونيدات (Quercetim) عند زمن احتجاز 7.5 دقيقة في جهاز (HPLC) للمستخلص النباتي

أما جدول(۱) يمثل قطر منطقة التثبيط بالملمتر للمستخلص النباتي ضد البكتريا العنقودية  Staph aureusوبكتريا Klebsiella و الخميرة  Candida albicans المسببة للالتهابات الجلدية والمعاملة بعدة تراكيز من المستخلص النباتي 200, 100, 50, 25 mg/ml  والرقم 6 يشير إلى عدم وجود منطقة تثبيط حول الحفرة والسيطرة هي ماء مقطر و كما موضح في الشكل (3) ايضا

جدول (1) قطر منطقة التثبيط بالملمتر mm لثلاث أنواع من العزلات والمعاملة

بعدة تركيز من المستخلص النباتي

العزلات الجرثومية	تركيز المستخلص النباتي mg/ml					السيطرة ماء مقطر
	200	100	50	25
Staph aureus	21 c	11 b	6 a	6 a	6 a
Klebsiella  oxytoca	32 b	30 b	6 a	6 a	6 a
Candida  albicans	31 b	29 b	6 a	6 a	6 a

الحروف المتشابهة تعني عدم وجود فروق معنوية ، والحروف المختلفة تعني وجود فروق معنوية عند مستوى إحتمالية 0.05

 

يتضح من الجدول ان قيمة التركيز المثبط الادنى MIC Minimum Inhibitory Concentration. للمستخلص النباتي ضد جميع العزلات هو (100 mg/ml)

وشكل رقم 3 يوضح ايضا صور لمناطق التثبيط للمستخلص النباتي بالتراكيز المختلفة ضد ثلاث انواع من العزلات الجرثومية Stauph aureus ،  Klebsiella  oxytoca ،Candida albicans .

شكل (3) صور لمناطق التثبيط حول كل حفرة للمستخلص النباتي لتراكيز مختلفة (200 ، 100 ،50 ، 25) mg/ml ،  ضد ثلاث انواع من العزلات الجرثومية Staph aureus ،  Klebsiella  oxytoca ،Candida albicans

C: حفرة السيطرة ( ماء مقطر )

هذه النتيجة لا تتوافق مع الباحث (Qahalleh et al.,2020 ) حيث اثبت هذا الباحث أن أوراق الزيزفون تمتلك فعالية مثبطة ضعيفة ضد البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة كرام . وأستخدم المستخلص الكحولي الايثانولي بطريقة الاقراص الورقية وأثبت الباحث انه اذا اذا مُزج نبات الزيزفون مع نبات آخر مثل   Althaea officinalis يعطي تآزراً واضحاً وتثبيطاً أفضل مما لو كان لوحده . ويمتلك فعالية ضد الأغشية الخلوية للبكتريا بقيمة تتراوح (MBIC 50 و 0.2 mg/ml)

وان النتيجة تتوافق مع الباحث ( 2022 Ali et al.,) حيث اثبت ان المستخلص  الفلافونيدي للنبات يثبط من نمو البكتريا العنقودية الذهبية Staph aureus   وان مستخلص الفلافونيدات يثبط الجذور الحرة بصورة اكبر من المستخلص القلويدي للنبات.

واثبت الباحث (Delnavasi et al .,2015) ان نبات الزيزفون من نوع Tilian rubra يحتوى على انواع من القلافونات مثل quercetin و apigenin و Luteolin في المستخلص الكحولي وتم تشخيصه بطريقة الكروموتوكرافيا السليكا جيل و 20 LH Sephadex .

وهناك دراسة أخرى تشير الى ان نبات الزيزفون وخاصة الزهور تحتوي على نسبة كبيرة

الزيوت الطيارة الى (%32-60) وتم الحصول عليها وتحليلها بواسطة جهاز الكروموتوكرافيا الغازية GC و GC / MS ان النوع Tilia cordata يحيوي على نسبة %13 من زيت اللينول Linallol.(Fitsion et al.,2007)

ودراسة اخرى أكدت ان نبات الزيزفون يمتلك فعالية مثبطة لبعض البكتريا المسببة لالتهاب القناة التنفسية وان البكتريا الموجبة لصبغة كرام تكون حساسة بتراكيز منخفضة للمستخلص المائي للزهور وان المستخلص الميثانولي يثبط من نمو اغلب العزلات البكتيرية مثل  Staph aureusو Streptococcus pneumoniae  و Klebsiella pneumoniae كما يثبط من تكوين الغشاء الخلوي  .Biofilm

(Ismail etal., 2019)

وأثبت الباحث (Hassanien et al .,2018) إن المستخلص المائي Tilla Cordata مع الدقائق النانوية للنحاس يمتلك فعالية تثبيطية عالية ضد البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة كرام وضد السرطان مثل الخلايا السرطانية في القولون والكبد والثدي خارج  الخلية ( In vitro).

و بحث آخر أشار ان الدقائق النانوية للفضة المصنعة من المستخلص المائي لنبات الزيزفور (الاوراق) يمتلك فعالية عالية كمضاد للأكسدة ومضاد للاورام    (Sagi and Cacan,2021)

كما وجد الباحث  Czerwinsk etal(2018)ان مادة  procyanidinالموجودة في زهور نبات الزيزفون تقلل من اعراض الالتهاب وخاصة التهاب البلعوم واللوزتين عن طريق تأثيرها على كريات الدم العدلة بتركيز 20 – 5 مايكرومول.

وهناك دراسة عند الزيزفون الفضي Tilia platyphyllos  وجد ان اعلى قيمة للفعالية المضادة للأكسدة كانت للفلافونيدات والفينولات الكلية والاحماض الفينولية.Razna et al. 2021 ))

واثبتت احدى البحوث  ان النشاط المضاد للميكروبات لعسل الزيزفون ضد البكتريا العنقودية الذهبية aureus Staphylococcus كان عالياً وقد أعطى منطقة تثبيط تصل إلى38) ملمتر) ولبكتريا القولون

E.coli   (32 ملمتر) وقد لوحظ أن جميع انواع العسل من أصل نباتي له تأثير مضاد للمايكروبات في درجات الحرارة المنخفضة (Gruznov et al., 2024).

ان المستخلصات الكحولية والزيوت الطيارة فعالة ضد الخميرة Candida albicans بقيمة تركيز مثبط ادنىMIC  تساوي ) 30 mg /ml   (Tambur et al.,2018) كما ان الدقائق النانوية للفضة والمصنعة من مسنخلص زهور هذا النبات تثبط من نمو الفطر phytophthora spp. وان قيمة التركيز المثبط الادنى للفطريات (MFC) تساوي (46-119) مايكروغرام / مللتر (Yigit&Turkan,2023) .

الاستنتاجات :

بعد اجراء التجارب حول تأثير المادة الفعالة ( الفلافونيدات ) في المستخلص الكحولي لاوراق نبات الزيزفون تبين ان له تأثير مضاد البكتريا الموجبة لصبغة كرام مثل :  Staphylococcus aureus والسالبة لصبغة كرام مثل Klebsiella و الخمائر مثل الكانديدا  Candida albicans  المسببة للالتهابات الجلدية بقيمة  MIC تساوي 100 mg/ml

التوصيات : يوصى بإجراء تجارب أخرى للمستخلص الفلافونيدي لاوراق نبات الزيزفون ضد أنواع اخرى من البكتريا مثل Pseudomonous, E.coli .

المصادر :

Al-Hani, M. (2008). Separation and Identification of Flavonoids From The aerial parts of Hyspericum tomentosum plant, MSc. Thesis in organic chemistry -Division of Therapeutic Materials, Faculty of Science / Department of Chemistry, Algeria.P.45.

Ali, S.A; Al-Atbi, H.S; Moein, F. and.. Ali B. M. (2022). Antibacterial and Antioxidant Activity of Flavonoid. Glycoside and Alkaloid extracts of Tillia cordata. Int. J. H.Sci, 6(S3):3976-39 83.

Barnes, J.; Anderson, L.A. and Phillipson, J.D.(2007) Herbal Medicines, 3rd edition.. Published by the pharmaceutical press. ISBN 978085696230.

Czerwinska, M. E; Dudek, M. K; Paw toska, K.A and Prus, A. (2018). The influence of procyanidins isolated from Small-leaved Lime flowers Tillia cordata Mill..) on neutrophils. Fitoterapia. V. 127 P: 115-122.

Delnavazi, M. R; Shahabi, M. and Yassa, N. (2015): Flavonoids from The leaves of Iranian. Linden; Tilia rubra subsp. Cauca Sica. RJP, 2 (3) 17- 22.dois 10,10/6.

Evan, W.C., Evans, D., & Trease, G. E. (2009). Trease and Evans Pharmacognosy (16^th). Edinburgh, New York: Saunders / Elsevier. ISBN 9780702029332,

Fitsion, I.; Tzakou, O.; Hancianu, M. and Poiata, A. (2007). Volatile Constituents and Antimicrobial Activity of Tilia tomentosa Moench and Tilia cordata Miller oils.J. Essent Oil Res, 19(2):183-185.

Gruznov, D.v.; Grusnova, O.A; Sokhlikov, A.B. ; Lobanov, A.V. (2024). Changes in the chemical composition and Antimicrobial Activity of Linden, Buckwheat and Sunflower Honey Stored at Low Temperature. Nutr. Food. Sci. 12 (2): Available from http://bit.ly/3wKED FC.

Hassanien, R.; Husein, D.Z. and Al-Hakkani, F. (2018). Biosynthesis of Copper nanoparticles using aqueous Tilia extract: Antimicrobial and anticancer activities. Heliyon, 4, e 01077 doi:10:1016

Ismail, A.; Hen eini, F. and. Nawas, T. (2019). Tilia cordata: A potent Inhibitor of Growth and Biofilm Formation of Bacterial clinical Isolates, worldwide. J. Pharm. Res, 8 (13): 147-158.

Natural Health product, Linden, Small Leaf – Tillia cordata (2017). Health canada,http://webprod. hc-Sc. ca /nh pid- bdipsn /at Req-do? atid. – Linden. tilleul. Smalleaf. Petites- feuilles lang = eng.

Negri, G.; Santi, D. and Tabach, R. (2013). Flavonol glycosides were found. In hydroethanolic extracts from Tilia cordata, a species utilised as an anxiolytic.Rev. Bras. Pj. Med.campinas, 15 (2): 217-224.

Pavlovic, T.; Dimkic, I.; Andric, Sr ;Milojkovic – opsenica, D. (2020). Linden tea from Serbia – an insight into the phenolic profile, radical Scavenging, and antimicrobial activities.Ind. Chop. Prod. V. 154 112639.

Qaralleh, H.; Al-Limoun, M.; Khlaifat, A. ; Al-Tawarah, N. et al. (2020). Antibacterial and Antibiofilm Activities of a Traditional Herbal Formula against Respiratory Infection-causing Bacteria. ToP. J.Nat.prod. Res, 4(9): 527-534.

Razna, K.; ziarovska, J.; Ivanisova, E.; urbanova, L. (2021). Flower Characteristics of Selected Species of Lime Tree (Tilia spp.) in Terms of miRNA-Based Markers Activity. Expression and Biological compounds content. Forests. 12 (12):1748.

Sargi Ko and Cacan (2021). Antioxidant and cytotoxic activities of silver nonoparticles synthesised using. Tilia cordata flower extract.Mat. Tod. Comm. V. 272 10 2316.

Tambur 9 Z.; Milosevic, D.C.; Mileusnic, I., Dober, R. (2018). Inhibitory effects of different Medicinal plants on Candida albicans growth. Med Water. 74(7): 473-476.

Tilia cordata flower extract in Skin care. What is? Lesille .. Linden flower extract. (2024). https://www.drugs.com/npp/ htm/8:44 AM.

Yigit,v. and Turk Kan, M. (2023). Antifungal activity and optimisation procedure of microwave Synthesis of silver nanoparticles. Using Linden (Tilia rubra) flower extract. Int. J. Chem Techno. 7(1): 195-207.

Zhou, Y. J; Ken, Q; Shen, Y. B. (2024). Comprehensive review of Tilia L., phytochemical profiles, edible therapeutic potential, and ecological significance Food Med. Hom., 2: 9420035. http://doi.org/10.26599/value,FMH 2024.